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如何有效監控脂質奈米顆粒的團聚狀況

使用FlowCam流式成像顯微鏡監控脂質奈米顆粒的團聚狀況

圖一、裝載活性藥物成分之脂質奈米顆粒示意圖

作為一種相對較新的生物治療方法，就如同過往蛋白質藥物剛被開發的時候一樣，目前有許多研究正致力於提高 LNP 的穩定性，和蛋白質藥相似，LNP 在儲存、冷凍、解凍或樣品處理時容易出現團聚和其他降解現象，目前為了維持其穩定性，LNP 配方必須在運輸和儲存時冷藏，儘管這些低溫儲存條件對保存 COVID-19 疫苗的效果是有效的，但它們卻增加了疫苗運輸和儲存的困難度及成本，尤其對於那些處在缺乏冷鏈資源地區的患者(特別是在較溫暖氣候的地區)，他們將難以獲得有效的疫苗配方。

因此，設計在標準冷藏條件下（或甚至室溫下）穩定的LNP配方就是一個重要的研究課題，只要改進了 LNP 配方的穩定性就可能會減少這些治療方法對冷鏈運輸和儲存的要求。
 

事實上，針對藥物不穩定導致的 API 團聚和其他藥劑內微粒帶來的安全風險，目前已經制定了相關法規（GMP）來要求並設定品質管控標準，這些標準可以確保製藥廠不會出貨具有顯著增加微粒數量的任何注射劑產品批次，特別值得注意的是，在 USP <788>（"Particulate Matter in Injections"）和類似法規中限制了商業化注射藥劑中可以存在的次可見微粒（subvisible）（粒徑在2-100µm之間的微粒）數量，因此，在前段提到的配方開發研究其實是和法規息息相關的，而產業中也將 LNP 和其配方設計的變化將如何影響這些藥物的微粒含量視為重要的檢查環節，並以最大限度地減少這些配方中微粒帶來的潛在產品安全風險。

流式成像顯微鏡（FIM）儀器常用於計數、測量和成像藥物配方中的 API 團聚物和其他微粒，同時，這個技術也非常適合用於分析 LNP 配方中的微粒。FIM 儀器結合了光學顯微鏡和微流道技術，以高通量（high-throughput）的方式捕捉這些微粒的影像，而這些微粒影像最終可用於計數，以獲得顆粒濃度（particles/ml），並通過影像分析軟體進行分析，來獲得微粒的大小和形狀訊息，最終，這些訊息可以用來優化藥劑配方、減少樣品團聚以提高穩定性，同時也可以在製造過程中追蹤藥物產品批次中的次可見微粒含量。
 

圖二、使用流式成像顯微鏡（FIM）捕捉之 LNPs 影像，影像下方顯示數值為將顆粒視為等效球體後的直徑（equivalent spherical diameter）

FlowCam 公司的 FIM 儀器，如 FlowCam 8100、FlowCam LO 和 FlowCam Nano，可以捕捉高分辨率的微粒影像，非常適用於分析 LNP 配方中的微粒。FlowCam 8100 和 FlowCam LO 可以提供次可見微粒的影像，包括那些受到 USP法規監管的微粒，且 FlowCam LO 還可對樣品進行光遮蔽（Light Obscuration）測量，這是 USP <788> 方法建議使用監測微粒計數和大小所需的技術，值得注意的是，在 <788> 後續追加補充的 USP <1788>（" Methods of Determination of Subvisible Particulate Matter "）中，其建議檢測人員應同時使用 LO 和 FIM 的組合，以驗證那些無光遮蔽性的透明微粒，補足單單使用光遮蔽法測量的缺點。

另一方面 FlowCam Nano 使用高倍率浸泡油物鏡頭（immersion oil objective）來成像次微米級的微粒（直徑為0.3-2µm），由於這個尺寸範圍略大於典型 LNP 單體的大小（50-300奈米）使得 FlowCam Nano 能夠成像小型 LNP 寡聚體，因此，FlowCam Nano 非常適合用於辨別 LNP 聚集的早期狀況，因為它可以檢測到可能形成的最小團聚物，雖然次微米級的微粒和團聚物不像次可見微粒那樣受到 GMP 法規的監管，但在配方中監測和減少較小的團聚物是有助於防止形成受 GMP 法規監管的更大團聚物，此外，作為一種高通量的動態影像分析技術，FlowCam Nano 可以比其他傳統的光學和電子顯微術技術更快速地揭示小型團聚物訊息，並利用高解析度的影像分析合成載體的製備過程。

本次的應用文章將討論如何使用 FlowCam 8100 和 FlowCam Nano 來分析 LNP 配方中的團聚物和微粒形成：實驗中的 LNP 配方將分別使用了兩種方法加速其團聚或降解（解凍及加熱），再以 FlowCam 8100 和 FlowCam Nano 分析其微粒濃度、大小和影像。
 

2.實驗方法

為了去除一開始便存在於樣品中的大顆粒，實驗前先將 15mL 的 LNP 配方（PBS分散）在 6000 rpm 的轉速下離心1小時，接著使用上清液 12mL 的樣品進行後續實驗。

首先我們將 5mL 的樣品快速結凍及解凍，做法上是將樣品在 -20°C 冷凍 20 分鐘，然後在室溫水浴中解凍 5 分鐘，進行四次凍結-解凍循環後，將樣品保持在室溫進行分析；另一方面，將一個 5mL 的樣品加熱，即將樣品放在 60°C 的水浴中加熱四小時，後將樣品冷卻至室溫進行後續分析。

本次實驗使用 FlowCam 8100 和 FlowCam Nano 進行分析，分別拍攝次可見微粒（subvisible）和次微米級（submicron）微粒。FlowCam 8100 儀器配置了灰度相機、10 倍物鏡和 FOV80 流動池，FlowCam 8100 對每個樣品進行了三次 200μL 的測量。FlowCam Nano 儀器使用 40 倍物鏡和 FOV60 流動池，而 FlowCam Nano 對每個樣品進行了三次 100μL 的測量。
 

圖三、FlowCam 8100（上）和 FlowCam Nano（下）所測得的顆粒濃度，每個表格被分為兩組，由顏色區分成四行。藍色行表示凍結-解凍樣品的測量結果，紅色行表示加熱樣品的測量結果。每組四行包含三個重複測量的平均顆粒濃度（最右上格），其餘每行表示每個單獨測量的顆粒濃度。

粒徑與計數測量:

圖四、FlowCam 8100（左）和FlowCam Nano（右）測得的顆粒粒徑分佈，分別針對凍結-解凍樣品（藍色）和受熱樣品（紅色）呈現，每個圖中均列有分布中位數直徑

如上圖四所示，每個尺寸範圍的微粒大小分佈也與這一觀察結果一致，雖然不同樣品間的次微米級微粒大小差異幾乎微乎其微，但相較於凍結-解凍循環處理產生的微粒分佈，加熱處理組別產生的次可見微粒大小分佈往較大的粒徑方向偏移，這些結果說明加熱處理對這種 LNP 配方的影響比凍結-解凍循環處理更大，前者產生了更高濃度的大顆粒，而後者則產生了包含更接近較小 LNP 微粒大小的顆粒。

 

除了使用 FIM 方法外，我們還使用動態光散射（DLS）測量這些樣品以確認變化趨勢是否具有一致性，下圖五顯示了結果中的微粒大小分佈，加熱處理的 LNP 配方展示了比凍結-解凍循環處理或未處理對照組更寬廣的微粒大小分佈，並偏向具有較大的粒徑，這個結果和 FIM 測得的結果具有一致性。
 

圖五、以動態光散射法測量之樣品粒徑分布狀況，組別分別有加熱處理、結凍-解凍循環處理及未處理的對照組

 

圖六、使用FlowCam 8100（左）和FlowCam Nano（右）獲得的兩個樣品的顆粒圖像，每個圖像下方的數值是顆粒的直徑（等效球狀直徑，ESD），以μm為單位

 

影像分析: 

上圖6顯示了從結凍-解凍循環處理和加熱處理樣品中獲得的 FlowCam 8100 和 FlowCam Nano 影像，這些影像也用於計算圖3和圖4中的樣品統計數據。根據這些影像，LNP 微粒通常沒有固定形狀，值得注意的是，在 FlowCam Nano 的影像中，不論樣品是被加熱處理或是結凍-解凍循環處理，影像中都顯示了更多明顯連接的微粒，這表明這些微粒可能是二聚體 LNP 結構，這一觀察結果表明，縱使只有寡聚 LNP 團聚物被產生，FlowCam Nano 也可以用於監測 LNP 的聚集。

 

我們認為 FlowCam Nano 和 FlowCam 8100 所提供的微粒影像訊息能讓用戶監測其配方中 LNP 的穩定性，並檢查其他常見的配方不穩定因素，如容器的相容性是否導致塑料顆粒被溶出，或是用於密封的潤滑油是否有油滴跑入藥品之中，而這些訊息對於優化或是挑選乘載 LNP 藥物來說均十分有用。

 

3.結論

FlowCam 可以用於監測 LNP 配方中的微粒含量和聚集，就像對許多其他生物製藥活性成分（API）一樣，並且 FlowCam 8100 和 FlowCam Nano 的測量提供了用戶有用的次微米級和次可見尺寸範圍的微粒數量和顆粒大小資訊，同時還提供影像，可用於追踪配方不穩定的因素。FlowCam Nano 尤其適用於這個目的，因為它提供的高倍率使得我們可以以高通量方式監測 LNP 聚集的早期情況以及其他可能的降解機制，我們相信從 FlowCam 獲得的訊息對於研究 LNP 配方的研究人員來說非常寶貴，能夠幫助他們及早監測和改進其配方的穩定性。