生物製劑藥品的品質監控: 如何區分蛋白質團聚物及其他顆粒

背景:
在腸外製劑藥(parenteral drug)中存在著許多顆粒，而這對於其開發及後續使用來說是不可忽視的一個環節，這些顆粒必須被監控並能符合USP法規(Ex: USP<788>)，實際上，在生物製劑產業，尤其蛋白質藥產業中，這些顆粒往往和藥物的效用及安全性有關，FDA法規中亦強烈規範業者須確實理解藥品中的顆粒特性，不論是粒徑及形狀參數都應該嚴格管控。
過往，遮光法(Light Obscuration)是常用於符合藥典的測量技術，用以監控腸外製劑的小顆粒(2-100μm)，雖然遮光法對計數和測量不透明粒子的大小十分有用，但在分析生物製藥物時卻不甚理想，這是因為這些藥品的活性藥物成分(API)的聚集體通常是高度半透明的；另一個遮光法的弱勢之處是在於其僅能提供顆粒的粒徑大小及計數功能，但對於顆粒的外觀訊息則是無法從測量過程中獲得，這就會對於顆粒的來源判讀有困難性，使用者將無法從遮光法獲得的資訊中分辨同樣大小的顆粒究竟是氣泡、矽油亦或是蛋白質團聚，回到法律設立的初心並無法真正的保障含有顆粒的生物製劑對使用者的安全與否。
回到剛剛提及的話題，顆粒形態訊息的其中一種用途是識別樣品中的矽油滴(silicone oil droplets)，矽油因常用作注射器潤滑劑，在藥劑使用過程中，注射器壁上的油層可能剝落於溶液中形成額外的顆粒，這些油滴有可能促使API的團聚，且導致使用者不良的免疫反應，基於上述原因，顆粒分析技術若能記錄顆粒形態訊息將有助於分辨這些顆粒的來源(矽油滴、API團聚物、玻璃或金屬殘骸、細胞殘骸及細菌等)，這些訊息將能協助業者生產更加安全且高品質的生物製劑。
流式影像顯微鏡(Flow Imaging Microscopy)是一個被USP法規認可的分析技術，作為遮光法或是其他藥典技術的互補功能(參見USP<1788>)，用以分析顆粒的粒徑、數量及外觀，FIM設備，如同FlowCam，能夠捕捉顆粒於微流道內的影像，利用這個方法我們能測量於流體中的顆粒大小，另一方面，顆粒濃度也將可以從拍攝的顆粒數及體積推算，這些會和拍攝速率、流體速率及微流道體積相關。也因為直接拍攝顆粒的關係，FIM法將可以得到這些顆粒的形狀訊息，這是遮光法沒辦法做到的，使用者可以通過觀察原始圖像數據或記錄的粒子測量值藉由FlowCam的VisualSpreadsheet軟體來辨別顆粒類型(例如區分API及汙染物)。
FlowCam LO是一個劃時代的整合設備，在一次的測量中便可以同時執行FIM及遮光法，這使得客戶能在一台儀器中便能滿足對於藥典法規的需求。
在本文章中我們將揭示以流式影像系統FlowCam測量生物製劑藥的效能，我們將以FlowCam8100機型測量一模擬蛋白質藥的樣品(樣品組成為蛋白模擬物和矽油滴)，FIM技術能夠更好的偵測透明樣品且計算其顆粒濃度，在此之上加上影像的分析，使用者可以在一次測量中獲得所以需要的訊息。
 
方法:
樣品由NIST認證的單株抗體加上矽油滴構成，配置手法及操作流程如下: 
  1. 單株抗體團聚物通過在15 mL 錐形管中加入2mL NIST單株抗體(1 mg/mL)於PBS緩衝液並用手大力搖晃配製
  2. 矽油滴則是將矽油準備至PBS緩衝液中，以體積百分比5%配製，並以攪拌器混和20秒
  3. 將步驟3之矽油滴0.2mL加入步驟1之樣品
  4. 將配製好的樣品取1毫升以FlowCam8100分析，儀器配置為黑白相機+10X物鏡+ 80μm FOV微流道
下圖一為實驗結束之視窗，裡面展示了顆粒粒徑分布及濃度結果，可從結果中發現樣品具有一個不對稱的粒徑分布圖及約為62000 particles/ml的顆粒濃度，不過上述資訊即便是使用遮光法亦能獲得，FIM的強大之處在於對於顆粒外觀的訊息(參見圖二)
如圖二所示，樣品呈現出不同的顆粒群，各種顆粒形態不等，從暗的球體顆粒到亮的棒狀顆粒均有，這樣的形狀訊息將無法從遮光法測量中獲得，並且對於那些亮度較亮的樣品，遮光法無法從對比度不夠高的狀態下分辨(相較於背景顆粒也亮，導致顆粒輪廓模糊)，如若使用FlowCam LO型號使用者將看出遮光度法對於那些光亮透明樣品的極限。
在圖二中特別值得注意的是亮度較暗但擁有亮輪廓邊界和亮中心點的顆粒群落，這些樣品即為樣品中的矽油滴，利用影像，使用者才能真正分辨蛋白質藥中究竟何為矽油滴，何為蛋白質團聚物，何為其他汙染顆粒，對於要分析有複雜構成的樣品來說FIM為一個最佳的方法，這不僅是相對於遮光法，舉例來說，有一個顆粒分辨技術稱為背景膜影像法(Background Membrane Imaging)便無法分辨矽油滴，因為矽油滴會在過濾時被濾除，因此在呈像前就會消失於樣品中。
圖一、本視窗為FlowCam VisualSpreadsheet軟體實驗結束的主要畫面，上方可以看到粒徑分布結果對應各自濃度的圖譜，下方表格為統計數據，包括有本次實驗計數的顆粒數及樣品推估濃度
圖二、VisualSpreadsheet軟體可以選擇樣品的圖像進行查看，示意圖中我們以粒徑排列顆粒(粒徑以等效球體粒徑表達)

樣品分析:
VisualSpreadsheet軟體可用於自動區分不同的蛋白質聚集體和矽油滴，在數據收集的過程中顆粒的各個特性將可以被計算，例如顆粒的粒徑、長短邊比(Aspect ratio)、亮度(intensity)…。由於不同種類的樣品都會有不同的特性，藉由軟體中的濾片(filter)功能或是分類(classification)功能，使用者可以客製自己的濾片套用在不同樣品上。
舉例來說，本次實驗我們便創建了一個”矽油滴”的濾片，藉由軟體中的” Like Selected Particles(Statistical)”功能，我們能在選取幾顆顆粒圖像後找出所有和選取顆粒擁有類似形狀參數的顆粒，在本次實驗我們便選取了50張矽油滴的照片創建濾片。
下圖三為套用濾片功能後找出的顆粒，可以發現這些普遍圓形且具有中心亮點的顆粒就是矽油滴，基於此濾片，我們可看出本次的混和樣品中每mL約有4700顆的矽油滴，這功能不僅僅適用於尋找矽油滴，也可用於找出其他具有特定形狀外觀的顆粒群落。
圖三、VisualSpreadsheet軟體可以建立濾片功能，示意圖中為silicone oil-like濾片找出的顆粒，下方數字為和silicone oil相似程度的數值，數值越低表示和矽油滴越類似
 
結論:
本次實驗顯示了FlowCam可以測量生物製劑樣品的粒徑及顆粒數量，並分辨其中的透明顆粒，這是其他技術並未能在單一機台中做到的，這樣的強大功能將對於樣品的品質管理更加方便且彈性。

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