前言:
本文章將說明如何使用像是FlowCam流式成像顯微鏡 (FIM) 系統去計算顆粒數目和判定顆粒濃度，本文適用於型號FlowCam 8000/8400、FlowCam Cyano 和 FlowCam LO，但和FlowCam 5000或FlowCam Nano無關，因為這些型號沒有 FOV 流動樣品槽，且也不適用轉至使用外部蠕動泵的FlowCam Macro，本文章還會給予使用者如何優化實驗參數設定及給樣手法的建議。
參數定義:
Particle Count: 給樣期間拍攝到的顆粒數目，此參數很大程度被使用者定義的捕捉參數設定或濾鏡設定影響
Particle Concentration: 每ml流體中含有的樣品量，通過記錄流體體積搭配捕捉的顆粒數除得，在軟體VisualSpreadsheet®中將以單位particles/ml呈現。
Efficiency: 拍攝紀錄的流體體積除以給樣期間流動體積的百分比，其取決於物鏡放大倍數、微流道尺寸、流速和拍攝速率，一個100%的Efficiency表明測量的顆粒計數相等於給定樣品的實際計數。
以流式影像法計數顆粒:
在流式影像分析系統(如FlowCam中)，當顆粒使用注射器被拉過微流道時，它們會越過相機的視野 (FOV)並在二維平面中成像(見下圖一)，該儀器的相機會捕捉FOV內的圖像並以每秒幀數(frames/second)為單位紀錄(在軟體VisualSpreadsheet中該參數被稱為AutoImage rate)，接下來每個畫面中的顆粒將被個別紀錄，分析過程中每個顆粒會在FOV花費固定間隔時間分析，為了確保計數精確度，我們希望每顆顆粒圖像不被多或少計算，每個畫面內的顆粒被記錄並在下個畫面中消失是最理想的，為了達成此目的，在特定微流道就該使用特定的流速及拍照頻率，這些設定皆可以在VisualSpreadsheet軟體中設定。
對於不同物鏡和微流道的搭配，設定正確的流速及拍攝速率是十分重要的，靠著這些參數設定我們才能得到精確的顆粒數分析結果，如果將拍攝速率設定的太快遠高於流速，那麼可能在兩個畫面中都會出現同一顆顆粒，導致重複計數；相反來說，如果將拍攝速度設定的太慢，可能會有部分顆粒在兩個畫面的間隔時間中流經微流道而不被拍攝到，導致顆粒數小於實際狀況(參見下圖二)
在VisualSpreadsheet的軟體中，有一參數我們稱之為Efficiency，其為以指定流速成像的總樣本量和拍攝速率的比值，此參數可以用作評斷流速及拍攝速率是否設定良好的指標。若Efficiency接近於100%通常會導致樣品重複計算，這是因為拋物線流(parabolic flow的關係)，像是水和有機溶劑的牛頓流體會表現出拋物線流，因為摩擦由牆壁引入流動通道產生阻力，使流體在外部邊緣減慢
這個流道，而這現象將會使靠近於微流道管壁較晚離開的樣品裡的顆粒被重複計數，為了防止上述情況的發生，在軟體中會建議即便為了獲取更多的影像而將拍攝速率盡可能地設高，也應該控制在Efficiency70%以下，以避免重複計數顆粒的狀況(參見下圖三)
請注意，圖三中顯示的Efficiency是估計值由樣品流速和拍攝速率計算而來，實際值會依照實驗時狀況以下公式計算:
想要在不導致重複採樣去且達成100%的Efficiency十分困難，因此我們通常不會用FlowCam系統測量絕對顆粒數，然而若是想藉由設定流動參數或是拍攝參數得到相對顆粒數或進行樣品間的比較都是沒問題的。
然而在適當的Efficiency條件下想得到精確的顆粒濃度是沒問題的，基本上顆粒濃度的計算是參考下方的計算方法:
雖然流體設置和儀器性能是獲得準確濃度的重要考慮因素，我們還是能從軟體和樣品著手改善測量的顆粒濃度。
如何盡可能的獲取準確的顆粒濃度:
捕捉顆粒的參數設定
在Context視窗中可以進行捕捉顆粒參數設定對於測量顆粒濃度來說舉足輕重，如何去優化此參數設定確保顆粒能各別捕捉是十分重要的事。若此參數沒設定好，有可能會導致多顆顆粒被記錄為單一顆粒，導致濃度推算小於實際狀況(參見下圖四)；反之，也可能導致單一顆粒被分為好幾顆計算，使濃度推算大於實際狀況(參見下圖五)。
由上述二例，我們可以說對於捕捉參數設定來說，相鄰顆粒間距(DNN)設定是最重要的一環，此參數即為定義顆粒的間距(以μm為單位設定)，確保相機能捕捉單一顆粒，當該值設定的越小，意味著即使是距離十分貼近的顆粒還是能夠各別捕捉。
對於一些透明樣品，像是蛋白質或是浮游植物，過低的DNN設定反而會導致單一顆粒被拆分為數個單一顆粒而被重複計算，此時應調整DNN為4-8μm，通常如此一來便能改善。
其餘捕捉參數，像是Segmentation Threshold和Close Holes也會影響顆粒濃度計算，Segmentation Threshold就是在設定和背景亮度相比，要多暗或多亮才會判定為一顆顆粒；Close Holes顧名思義則是設定用於填充畫面中小像素的間隔，當Segmentation Threshold設定過高時這將十分重要，上述兩個參數如果設定為最佳化就會容易導致實驗過程中的顆粒圖象被裁切或是丟失，導致濃度的計算錯誤。
基於上述理由，我們十分建議您在首次使用FlowCam系統或是測量一未知樣品時，先使用File processing mode執行實驗，在這模式下儀器將自動最佳化顆粒捕捉參數，關於File processing mode是如何最佳化參數設定，您可以參閱VisualSpreadsheet 用戶指南，您可以在FlowCam電腦的桌面上找到。
樣品濃度
當樣品濃度過低，即便是一顆顆粒被重複計數或是被忽略都將導致顆粒濃度的重大影響，在此情況下，我們建議您寧願設定參數可能導致重複計數之後再去影像數據庫剃除也不要設定為有機率丟失圖象的狀況，且如果樣品量充足我們建議您盡可能的上樣以獲取足夠大的樣本數使數具可信賴。
另外當樣品濃度過高，導致數顆顆粒被視為單一顆粒，將導致濃度計算誤差(參見下圖六)。
最大樣品濃度取決於幾個因素包括使用的物鏡、微流道深度、樣品粒徑和捕顆粒參數設定，但當樣品濃度過高我們還是能透過溪是樣品來改善分析條件，只需要使用分散樣品本來的溶液或是常見的蒸餾水或磷酸鹽溶液即可，當樣品濃度過濃導致複數顆粒被視為單一顆粒的比例較小，則可以試著稀釋樣品2-10倍，而當複數顆粒被視為單一顆粒的比例偏高，則應稀釋更高倍率約100-1000倍都有可能。
如若稀釋樣品唯一必要手段，我們可以透過在下圖視窗中輸入稀釋倍率來回推原始樣品濃度。
樣品處理
為了得到準確的濃度結果，將樣品盡可能地分散完美將是重要的，我們建議您在測量前可以手動來回倒置樣品或使用移液器抽吸樣品以求分散穩定避免沉澱團聚的樣品，對於那些較為脆弱的樣品，像是蛋白質或是API藥物則輕微搖晃樣品即可。
樣品密度亦為需要考量的因素，當樣品密度高導致沉降會致使濃度推算的錯誤，建議在取出樣品後立即上機避免時間拉長導致沉降效應的產生，以下為針對易沉降樣品的建議:
- 將樣品拆分為數個小體積的份量執行實驗，讓沉降發生的機率下降
- 提高實驗流速
- 嘗試使用密度稍高的溶劑，使顆粒沉降發生的機率下降
結論
FlowCam 8000系列儀器提供各種流體樣品計數和濃度的數據，得到的相度濃度結果在樣品間的比較是十分可信的，本篇文章通過了解和考慮各種可能影響報告濃度的因素讓使用者能得到更加精確的濃度結果。
