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引言
本研究探討了甘露醇和海藻糖結晶對單克隆抗體IgG1在不同pH條件下反复凍融狀態下的影響。配方在−20°C下退火20小時5次(通過凍融中斷)。這樣做是為了誘導賦形劑結晶。凍融樣品的特徵是通過圓形二色、顆粒分析和尺寸排除色譜進行的。
介紹
在冷凍狀態儲存和凍乾的蛋白質配方中,冷凍步驟是關鍵,因為它決定了蛋白質的穩定性。很好地表明,在穩定的配方中,像甘露醇這樣的膨化劑會結晶,而在冷凍和儲存過程中,如海藻糖這樣的低溫防護劑應該保持無定形。增殖劑和冷凍的結晶作用取決於它們的相對濃度以及在配方中蛋白質的濃度。例如,在配方中,一種更高的牛血清白蛋白(BSA)濃度會抑制,甚至完全抑制結晶。其他添加劑,如表面活性劑,也會影響蛋白質的穩定性。目前還不知道,如果所有蛋白質對配方的狀態有類似的影響,在冷凍過程中表現得類似。在本研究中,通過改變對甘露醇比的不同配方,探討了單克隆IgG1抗體的冷凍反應。由於pH值對抗體穩定性的影響,pH值的影響也參與到了研究。該研究的關鍵參數是抗體的形成、聚集和顆粒的形成,以及凍融後配方的宏觀外觀。
材料
D-(+)-海藻糖二水合物(MW 378.33 kDa, 99.9%純度，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)， Tween 20 (MW 1227.54 Da，>98.0%純度，Biorad Laboratories, Hercules, CA)，和D-甘露醇(MW 182.17 Da，≥98%純度，Sigma-Aldrich)。原液在10mM磷酸鈉緩衝液中按重量法配製pH (梅特勒- toledo MP220 pH計，Greifensee，瑞士)。以單克隆抗體(IgG1)作為模型蛋白。所有配方在使用前均通過0.2 μm聚醚砜膜注射器過濾器(VWR International GmbH, Ismaning, Germany)過濾。
凍融實驗
凍融實驗使用FTS LyoStar™3凍乾機(SP Scientific, Stone Ridge, NY, USA)進行。 2 R小瓶(Fiolax™clear, MGlas AG, Münnerstadt，德國)填充2.0 mL樣品溶液和塞(塞類型:Westar®，West Pharmaceutical Services, Eschweiler，德國)。將架子溫度提高到−20℃(1℃/min)，然後等溫保存20 h，以冷卻樣品。在−20℃保存20 h，我們假設完全冰結晶，任何非晶相的流動性和海藻糖的結晶都是有利的。將架子溫度提高到20°C，以1°C/min解凍樣品。在選定的小瓶中通過熱電偶監測產品溫度。凍融循環最多重複五次。
檢測方法
1. 流式顆粒成像分析法（FIA）
FlowCAM®8100系列成像儀配備了高分辨率相機(1920×1200像素，10倍放大)，用於可視化和計數每毫升樣品的亞可見顆粒。樣品體積為0.20 mL，流速為0.15 mL/min。系統在測量之間用純淨水沖洗，或用Helmanex®去除流池中的殘留蛋白。使用VisualSpreadsheet®軟件進行數據分析。
2. 光阻法（LO）
3. 高效排阻色譜(HP-SEC)
4. 濁度(A350nm)
5. 紫外線圓二色性(CD)
UV CD數據來自新鮮和冷凍解凍的IgG配方。 H(r) -正螺旋，H(d) -扭曲螺旋，S(r) -正螺旋，S(d) -扭曲螺旋。溶液被冷凍並在−20°C退火20小時。所有樣品都被重複分析。
在pH為4和7的條件下循環5次後，甘露醇/海藻糖/IgG製劑的亞可見顆粒數≥25、10和1 μm (FT前的顆粒數分別低於5、20和200顆粒/ mL)。
經過5次FT循環後，配方和pH值4(上一行)和pH值7(下一行)的外觀。
經過5次FT循環後，pH為3的配方的外觀(上排)和0.1%的ps20(下排)。
在pH為3的條件下，在不添加或添加0.1% PS20的情況下，5次FT循環後，亞可見顆粒數≥25、20和1 μm。
結論
在pH為3的條件下，在不添加或添加0.1% PS20的情況下，5次FT循環後，可溶性團聚體和單體含量增加。
溶液中的顆粒數只有在pH為5的條件下經過多次凍融循環後才會增加。可溶聚體含量、渾濁度和宏觀外觀在pH為4和7時無明顯差異。在pH 3時，單體回收率大大降低，但與pH 4或pH 7時相比，沒有引起聚集或顆粒數增加。 ps20通過覆蓋冰液界面，在很大程度上可以阻止可見和亞可見顆粒的形成。成分對顆粒形成和濁度的影響可以忽略不計。然而，無輔料配方的單體回收率要高得多，這意味著甘露醇和海藻糖結晶有助於蛋白質的展開，類似於BSA的結果。選擇甘露醇和海藻糖的比例，甘露醇和海藻糖很可能結晶。因此，IgG1在沒有甘露醇和海藻糖晶體的情況下似乎更穩定。 IgG1的展開強烈地依賴於配方的pH，但不能直接與不溶性和可溶性團聚體的形成聯繫。以牛血清白蛋白作為模型蛋白的研究也顯示了類似的結果。因此，我們觀察到不同類型的蛋白質(球狀和抗體)之間的相似性。 pH值、FT循環次數、表面活性劑的添加和結晶賦形劑的影響是多方面的。其中一個參數的變化可以以不同的方式影響不同的分析，並表明使用正交方法進行表徵的重要性。
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